szpital dziecięcy rybnik

Po transfekcji komórki były głodzone w surowicy w DMEM i pożywce ITS przez 48 godzin, a następnie przez nocną stymulację PMA (200 ng / ml) lub IL-1 p (25 ng / ml). Testy lucyferazy oznaczano ilościowo w liczniku Victor2 Multilabel (Perkin Elmer Inc.). Wyniki znormalizowano pod względem aktywności (3-galu i wyrażono jako procent kontroli WT. Immunohistochemia. Komórki wysiewano na nietraktowane lub powlekane fibronektyną szkiełka komorowe i głodzono surowicę przez 24. 72 godziny, a następnie stymulowano IL-1 .. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie lub metanolu, przemyto PBS i permeabilizowano 0,1% Triton X-100. Po zablokowaniu komórki inkubowano przez noc z pierwotnym króliczym przeciwciałem anty-NF-kB (p65, Santa Cruz Biotechnology Inc.) w temperaturze 4 ° C lub Alexa Fluor 568 phalloidin (A-12380, Molecular Probes Inc.) przez godzinę w 25 ° C. ° C, a następnie godzinę inkubacji z drugorzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z FITC lub TRITC. Frakcje białek komórkowych i test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. Ekstrakty jądrowe wytworzono w sposób opisany uprzednio (24) z następującymi modyfikacjami. Komórki przemyto lodowatym PBS i lizowano w buforze A, który składał się z 0,1% Tritonu X-100, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, mM DTT, 0,5 mM PMSF i proteazy. koktajl inhibitorowy (P-8340, Sigma-Aldrich). Po odwirowaniu przy 1200 g przez 10 minut, supernatant przechowywano jako frakcja komórek cytoplazmatycznych, podczas gdy peletkę jądrową przemywano raz w PBS, ponownie zawieszano w buforze C (1 mM EDTA, mM EGTA, 0,4 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 25% glicerol, mM DTT, 0,5 mM PMSF i koktajl inhibitora proteazy) i inkubowano w 4 ° C przez 10 minut. Ekstrakt jądrowy wirowano przez 10 minut w temperaturze 4 ° C przy 12 000 g, a supernatant stosowano do analizy analizy Western i testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej. NF-pB-specyficzne oligonukleotydy (Promega Corp.) znakowano końcowo przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 i [a-32P] ATP (DuPont NEN Research Products, Boston, Massachusetts, USA). Ekstrakty jądrowe inkubowano wstępnie przez 10 minut w buforze wiążącym, a następnie 20 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej ze znakowanym oligonukleotydem. Próbki rozdzielano na 4% natywnym żelu poliakryloamidowym. Do badań konkursowych użyto nadmiaru (50 razy) nieznakowanego oligonukleotydu, a do testu supershift ekstrakty jądrowe inkubowano z 2 .g przeciwciała przeciw-p50 lub anty-p65 (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Analiza statystyczna. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono co najmniej trzy niezależne czasy. Dane są wyrażone jako średnie. SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania PRISM 4.0 i INSTAT (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Dane analizowano za pomocą niesparowanego testu t (umożliwiającego różne SD), jednoczynnikowej ANOVA lub testu Manna-Whitneya w przypadku dystrybucji nieparametrycznej. Dwustronna wartość P poniżej 0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki Mechanika jądrowa. Aby zbadać rolę laminatu A / C w mechanice jądrowej, fibroblasty zarodkowe myszy pochodzą z Lmna. /. i myszy Lmna + / + hodowano na przezroczystych błonach i poddawano etapowemu wzrostowi odkształceniu dwuosiowemu (pierwszy etap: 10,1%. 0,18%, drugi etap: 18,2%. 0,07%). Cytoszkielet, przyłączony do membrany przez receptory integryny, jest wystawiony na to samo odkształcenie dwuosiowe co membrana, podczas gdy sztywniejsze jądro wykazuje tylko małe odkształcenia w komórkach WT (25). Indukowane deformacje jądrowe obliczono śledząc fluorescencyjnie znakowane jądro (Figura 1, aib) i znormalizowano do szczepu błonowego, aby zrekompensować niewielkie zmiany w przyłożonym odkształceniu błony. Dla każdego typu komórek odkształcenie jądrowe wzrastało w przybliżeniu liniowo przy stosowanym odkształceniu membranowym (Figura 1c), ale Lmna A /. jądra wykazały znacznie większe odkształcenia niż komórki WT (ryc. 1, c i d)
[przypisy: olx lubawa, nowotwór wątroby, niewydolność nerek objawy ]