Aneksyna II i krwawienie z ostrą białaczką promielocytową cd

Szkiełka następnie przemyto pięć razy i wybarwiono kontrastowo błękitem Evansa lub jodkiem propidyny. Test aktywacji plazminogenu
Komórki wstępnie inkubowano z 100 nM lizyną-plazminogenem lub 200 nM plazminogenu glutaminowego (Immuno, Wiedeń, Austria) przez jedną godzinę w 21 ° C. Następnie 10 nM t-PA (Genentech, South San Francisco, CA) i substrat plazminy d-walino-leucyno-lizyno-7-amino-4-trifluorometylo-kumaryny (AFC-81, Enzyme Systems Products, Dublin, CA, USA). ) mieszano i dodawano w obecności lub nieobecności następujących inhibitorów: amiloryd (Sigma), IgG bez urokinazy (nr 3940A, American Diagnostica, Greenwich, Conn.), IgG przeciwko t-PA (numer 364B, amerykański Diagnostica), anty-aneksyna II IgG (Oncogene Research Products, Cambridge, Mass.) I anty-aneksyna I IgG (Zymed, San Francisco). Cięcie substratu mierzono w dwóch lub trzech powtórzeniach w dwuminutowych odstępach (wzbudzenie, 400 nm, emisja, 505 nm) z 2-nm szerokościami szczelin w spektrofotometrze fluorescencyjnym (model 650-10S, Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut) jako opisane w innym miejscu. 35 IgG przeciwko aneksynie I i IgG przeciw aneksynie II traktowano wstępnie karboksypeptydazą B-sefarozą, jak to opisano gdzie indziej.41
Test ochrony rybonukleazami
Podstawy od 51 do 350, kodujące unikalny region ogonowy aneksyny II, 42 zostały zamplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy z ludzkiego komplementarnego aneksyny II (cDNA) 34 przy użyciu starterów 5 AAAGGATCCTGTCTACTGTTCACG3 i 5 AAAGAATTCCCAAAATCACCGTCT3 , zligowanych do pBluescript KS (+) w miejscach restrykcyjnych EcoRI i BamHI, 43 i namnażane w transformowanej Escherichia coli wybranej na podstawie jego oporności na ampicylinę. Plazmidy wyizolowano za pomocą zestawu Maxi-Prep (Qiagen, Chatsworth, CA), zlinearyzowano za pomocą EcoRI i oczyszczono. Znakowane izotopowo sondy dla aneksyny II i dehydrogenazy fosforanu gliceraldehydowego (Amersham, Arlington Heights, IL) zostały transkrybowane zestawem transkrypcji RNA (Stratagene, La Jolla, CA) oraz zastosowaniem [3P] trifosforanu urydyny i RNA T3 lub T7 polimerazy z wytworzeniem 377-zasadowych i 139-zasadowych antysensownych rybosób z odpowiednio 300-zasadowymi i 100-zasadowymi celami. Hybrydyzacje przeprowadzono za pomocą zestawu Direct Protect (Ambion, Austin, Tex.). Dwuniciowo zabezpieczone fragmenty RNA wizualizowano przez autoradiografię wysuszonych żeli (7 M mocznik, 6 procent poliakryloamidu i TRIS, boran i bufor EDTA) i analizowano przez densytometrię lub oznaczano ilościowo za pomocą aparatu Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
Nuclear Run-On Assays
Wektor pBluescript zawierający 300 zasad sekwencji ogonowej aneksyny II i plazmid pBR322 zawierający 4,5 kb sekwencji rybosomalnego RNA 28S (dostarczone przez Dr. I. Gonzales, Hahnemann Hospital, Filadelfia) wykorzystano do przesiewu radioznakowanych produktów transkrypcyjnych w w testach.44 Plazmidy zlinearyzowano i zastosowano na błonach nitrocelulozowych za pomocą próżniowego urządzenia typu slot-blot (Hoefer Instruments, San Francisco). Radioznakowane transkrypty oczyszczono jak opisano w innym miejscu 44 i hybrydyzowano w 65 ° C przez 36 godzin.
Transfekcja komórek APL-1
Komórki APL-1 (2 x 106 na mililitr) inkubowano z 20 .g Lipofectin na mililitr (Life Technologies, Gaithersburg, MD) i wektor ekspresyjny aneksyny II, pCMV5-aneksyna II (2 .g na mililitr na 24 godziny) ; uzupełniony minimalnym niezbędnym medium; i testowano plazminę po 48 godzinach. 34 Skuteczność transfekcji oceniano na podstawie ekspresji aktywności .-galaktozydazy po wprowadzeniu pSV-.-galaktozydazy (Promega).
[podobne: alprazolam, noni, Białkomocz ]
[więcej w: misy tybetańskie, młody jęczmień zielony, dermatolog trzebnica ]