Respondenci ponownie zawieszono w pożywkach do hodowli komórkowych zawierających brefelinę (GolgiPlug, BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA) i rekombinowaną hIL-2 (10 ng / ml). Aby wyliczyć odpowiedź allogeniczną, osoby reagujące wysiano na 96-studzienkową płytkę w stosunku 1: (1 x 106 komórek na studzienkę) za pomocą stymulatorów (przygotowanie splenocytów od naiwnych zwierząt, allogenicznych [BALB / c] lub syngenicznych). W celu ilościowego określenia odpowiedzi wirusowej, preparaty odpowiadające inkubowano albo z peptydami wirusowymi (LCMV i VSV) albo z zakażonymi komórkami stymulacyjnymi, jak opisano wcześniej (20, 21). Odpowiadający osobnicy, nieistotny peptyd lub stymulacja splenocytami syngenicznymi była stosowana jako kontrola swoistości. Wszystkie stymulacje prowadzono przez 4-5 godzin w 37 ° C. Wewnątrzkomórkowe wybarwianie IFN-y przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw Cytofix / Cytoperm, BD Pharmingen). Krew obwodową analizowano przez wybarwianie za pomocą wskazanych przeciwciał skoniugowanych z fluorochromem (BD Pharmingen), a następnie lizę czerwonych krwinek i przemywanie zestawem do lizy pełnej (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Cytometria przepływowa została przeprowadzona na FACSCalibur, a dane analizowano za pomocą oprogramowania Cellquest (Becton-Dickinson, Braintree, Massachusetts, USA). Selekcje komórek uzyskano stosując system sortowania magnetycznego MACS (Miltenyi BioTec, Auburn, California, USA). Analizy statystyczne. Analizy statystyczne przeprowadzono stosując test U Manna-Whitneya dla przeżycia przeszczepu skóry; w przeciwnym razie użyto testu ucznia. Wyniki Infekcje wirusowe indukują heterologiczne allospecyficzne efektorowe i pamięciowe reakcje. Chociaż wcześniejsze badania zarówno u myszy jak iu ludzi udokumentowały allospecyficzną aktywność cytotoksycznego limfocytu T (CTL) zaraz po infekcji wirusowej (9. 11), niewiele jest informacji ilościowych dotyczących zatrzymywania alloreaktywnych komórek T pamięci po infekcjach wirusowych i ich potencjalnym wpływie na przeszczepianie. . Jako wstępne podejście do określenia, czy wcześniejsza ekspozycja na patogeny wirusowe może wpływać na odpowiedź na przeszczepione allogeniczne tkanki, badaliśmy ekspansję i retencję swoistych dla wirusa i alloreaktywnych komórek efektorowych i pamięci podczas i po ostrych infekcjach wirusowych LCMV (szczep Armstronga), VV lub VSV. Każdy z tych wirusów wywołuje ostrą infekcję, która stymuluje odpowiednią odpowiedź immunologiczną, co powoduje szybki klirens patogenu i generowanie stabilnej populacji limfocytów T pamięci, która utrzymuje się przez całe życie myszy (20, 22, 23). Myszy (C57BL / 6, H-2b) infekowano poszczególnymi wirusami, a liczbę komórek wytwarzających IFN – y specyficznie wobec wirusa i alloreaktywnych (stymulowanych H-2d) mierzono w fazie efektorowej (odpowiedź szczytowa) lub w fazie pamięci (ponad 6 tygodni po zakażeniu) po usunięciu wirusa. Dla porównania, mierzyliśmy wielkość odpowiedzi komórek T przeciwko dawcy podczas i po przeszczepie skóry (Figura 1). Dopasowane na podstawie wieku myszy kontrolne naiwne oceniane w podobnych punktach czasowych nigdy nie wykazywały wykrywalnych odpowiedzi antywirusowych lub anty-H-2d (dane nie pokazane). Figura Analiza odpowiedzi wirusowych i allogenicznych in vivo. Myszy B6 zainfekowano LCMV, VV lub VSV. Wyniki są wyświetlane dla szczytu odpowiedzi, jak również podczas fazy pamięci (ponad 6 tygodni). Dla porównania pokazano również odpowiedź na allograft skóry. (a) Reprezentatywne wykresy punktowe pokazujące liczbę komórek T CD8 + IFN – (3 + reprezentujących odpowiedź przeciwwirusową (LCMV-NP396-404, stymulatory zakażone VV, peptyd VSV-N, lewe panele) i odpowiadające im heterologiczne odpowiedzi allo-specyficzne (prawe panele). (b) Liczba charakterystycznych dla wirusa (NP396-404, wypełnione kwadraty) i indukowane wirusem, alloreaktywne komórki T (stymulowane H-2d, wypełnione trójkąty) po zakażeniu LCMV są wyświetlane w czasie
[przypisy: napięciowe bóle głowy, nefropatia cukrzycowa, napięciowy ból głowy ]
