Mikroiniekcje wykonano za pomocą mikroprocesora Eppendorf z Eppendorf Femtotips (Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy). W każdym naczyniu, 20 ~ 50 komórek zostało wstrzykniętych znakowanym Texas Red. 70-kDa dekstranem (Molecular Probes Inc.) rozpuszczonym w stężeniu 10 mg / ml w PBS (Invitrogen Corp.) albo do cytoplazmy (ciśnienie wtryskiwania 500 hektopaskali [hPa ], czas wtrysku 0,6 sekundy) lub do jądra (ciśnienie wtrysku 10, 100, 500 i 1500 hPa, czas wtrysku 0,6 sekundy). Po mikroiniekcji komórki płukano w HBSS (Invitrogen Corp.), a wewnątrzkomórkową lokalizację dekstranu. Texas Red rejestrowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wybrane membrany silikonowe poddano ciągłemu dwuosiowemu szczepowi (około 32% przez 30 minut) lub cyklicznemu odkształceniu dwuosiowemu (10% przy Hz przez 24 godziny), a lokalizację dekstranu znakowanego Texas Red. w komórkach szczepionych i kontrolnych analizowano na fluorescencji. mikroskop (Olympus America Inc.). Doświadczenia szczepu. Stymulacja szczepu została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem (22). W skrócie, komórki wysiano na powleczone fibronektynie błony silikonowe (2 500-3 300 komórek / cm2). Po 72 godzinach głodzenia w surowicy komórki poddano cyklicznemu odkształceniu dwuosiowemu (4% lub 10% przy Hz). W celu stymulacji chemicznej komórki inkubowano z IL-1 p (25 ng / ml; R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) lub PMA (200 ng / ml, Sigma-Aldrich) w DMEM plus ITS. Lokalizacja DsRed / peroxiredoxin-2. Komórki wysiewano na szklane płytki powlekane fibronektyną lub membrany silikonowe powleczone fibronektyną. Po inkubacji przez noc komórki transfekowano konstruktem fuzyjnym napędzanym promotorem CMV DsRed / peroksiredoxin-2 (CLONTECH Inc., Palo Alto, California, USA) stosując FuGENE 6 (F. Hoffman. La Roche Ltd., Bazylea, Szwajcaria) i. inkubowano przez 24 godziny. Wybrane membrany silikonowe poddano stałemu (około 19% przez 60 minut) lub cyklicznemu odkształceniu dwukierunkowemu (10% przy Hz przez 3 godziny), a lokalizację wyznakowanej DsRed peroksysedoksyny-2 w szczepionych i kontrolnych komórkach analizowano na mikroskopie fluorescencyjnym. (Olympus America Inc.). Cytometrii przepływowej. Do testów na żywotność komórek, jodek propidyny (2 .g / ml, Sigma-Aldrich) dodano do płytek po 24 godzinach od szczepienia. Komórki zebrano i analizowano za pomocą cytometru przepływowego Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., Fullerton, California, USA), licząc 10 000. 30 000 zdarzeń w każdej grupie. Wartości progowe dla wbudowania jodku propidyny określono na podstawie kontroli negatywnej (brak barwienia jodkiem propidyny) i pozytywnej (komórki permeabilizowane 50% etanolem). Apoptotyczne i nekrotyczne frakcje komórek mierzono w podobnych eksperymentach przy użyciu zestawu do oznaczania apoptozy Vybrant nr. 3 (Molecular Probes Inc.). Analizy północne i zachodnie. Ekspresję mRNA dla iex-1 i egr-1 oceniano za pomocą analizy Northern, jak opisano poprzednio (23). Ekspresję białka analizowano za pomocą analizy Westernowej frakcji komórek jądrowych i cytoplazmatycznych przy użyciu przeciwciał przeciwko NF-kB p65 (przeciwciało nie rozpoznaje p50 lub p105), I (BB. (zarówno z Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), jak i aktyny (Sigma-Aldrich). Dodatkowe lizoblotowanie przeprowadzono na lizatach całych komórek, stosując specyficzne przeciwciała przeciwko całkowitej ERK1 / 2 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i fosfo-p44 / p42 MAP kinazy (Cell Signaling Technology, Beverly, Massachusetts, USA). Po inkubacji z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z HRP (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA), specyficzne prążki wizualizowano przez wzmocnioną chemiluminescencję (PerkinElmer Inc., Boston, Massachusetts, USA). Eksperymenty z lucyferazą. Komórki transfekowano plazmidami dla kontrolowanej ekspresji lucyferazy NF-kBc i regulowanej przez SV40 y-gal (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) stosując FuGENE 6 (F
[podobne: nerwica serca objawy, mięsak kości, niewydolność żylna ]
